Les malalties genètiques segueixen sent un repte global, ja que són causades per mutacions en gens que afecten les funcions biològiques, els processos metabòlics o la producció de determinades proteïnes essencials dels individus, a diversos trastorns hereditaris. Els fàrmacs de teràpia gènica són un tipus d'intervenció terapèutica que s'adreça a gens específics, amb l'objectiu de reparar-los o modificar-los, i proporcionen noves instruccions perquè les cèl·lules produeixin proteïnes funcionals o intervenguin en els defectes genètics que causen malalties.
Els fàrmacs genètics comuns inclouen principalment l'ADN i l'ARN, on l'ADN pot ser fragments de gens o seqüències de gens amb efectes terapèutics. Aquest ADN es lliura a les cèl·lules per substituir o complementar les funcions gèniques defectuoses o que falten. L'ARN pot ser ARN missatger (ARNm), ARN interferent petit (siRNA) o oligonucleòtids antisentit (ASO), etc., que es poden utilitzar per modificar, inhibir l'expressió de gens nocius o restaurar la funció de gens específics.
Tanmateix, tant l'ADN com l'ARN s'enfronten a molts reptes des d'entrar al cos humà fins a arribar a les cèl·lules diana. Com que les seqüències gèniques són inestables al tracte gastrointestinal, normalment s'administren per injecció intravenosa o subcutània, però tot i així, la majoria de seqüències gèniques encara estan degradades per les abundants nucleases del cos humà.
Quan una petita quantitat de fàrmacs gènics residuals arriba a l'exterior de les cèl·lules diana, no poden entrar a les cèl·lules perquè les seqüències gèniques són molècules grans amb grups fosfat que porten càrregues negatives, mentre que les membranes cel·lulars també porten càrregues negatives. Quan dues càrregues negatives es troben, els gens es repel·leixen i no poden entrar a les cèl·lules. Per tant, hem de desenvolupar mètodes específics de lliurament de fàrmacs gènics per prevenir la seva degradació in vivo i millorar l'eficiència de la penetració de la membrana cel·lular i lliurar seqüències d'ADN o ARN a les cèl·lules sense problemes.
Mètodes de lliurament de fàrmacs genètics
Els mètodes de lliurament de gens comuns actuals es divideixen principalment en dues categories: lliurament de vectors virals i lliurament de vectors no-virals. El lliurament de vectors virals inclou principalment virus associats a adeno-(AAV) i lentivirus, etc., que poden simular el procés d'infecció per virus de les cèl·lules hostes i creuar fàcilment les barreres cel·lulars, aconseguint així una alta eficiència de lliurament. Tanmateix, el lliurament de vectors virals també té problemes: primer, té una capacitat d'envasament limitada, com ara la capacitat màxima d'envasament de l'AAV és de 4,7 kb, que no pot lliurar seqüències de gens més llargues; en segon lloc, els vectors virals poden provocar reaccions immunitàries greus, inclosa la immunitat cel·lular i la immunitat humoral, la qual cosa comporta riscos per a aplicacions clíniques. En comparació amb això, els vectors no-virals tenen grans avantatges en seguretat i capacitat de càrrega de fàrmacs.
Els vectors no-virals que s'utilitzen habitualment inclouen principalment liposomes, polímers, nanopartícules, exosomes, etc., entre els quals els liposomes es troben vesícules formades per molècules amfifíliques amb diàmetres que van des dels 100 nm fins a 1 um. Estan formats principalment per fosfolípids, colesterol, lípids PEG i lípids catiònics. L'estructura de la bicapa fosfolípid és similar a les membranes cel·lulars i pot entrar a les cèl·lules sense problemes mitjançant l'endocitosi. A més, els liposomes també poden modificar PEG o anticossos específics a les seves superfícies per escapar de l'eliminació immune del cos mentre s'orienten a teixits o cèl·lules específiques. Els liposomes catiònics són liposomes que contenen lípids de sal d'amoni quaternaris carregats positivament, que es poden unir millor amb fàrmacs d'àcid nucleic carregats negativament i mantenir l'estabilitat del sistema de lliurament. Per tant, els liposomes són un dels mètodes habituals de lliurament de vectors no-virals per als fàrmacs genètics.
Tanmateix, els liposomes tradicionals també tenen alguns problemes: en primer lloc, a causa de la gran extensió dels diàmetres dels liposomes, tot i que això pot garantir una capacitat suficient de càrrega de fàrmacs, quan els liposomes passen per la bretxa endotelial vascular (100-200nm), una mida massa gran dificultarà aquest procés. A més, després que els liposomes entren a les cèl·lules a través de l'endocitosi i formen el sistema endosoma-lisosoma, els liposomes tradicionals no poden completar l'escapada lisosomal a temps, cosa que fa que la majoria de fàrmacs genètics siguin degradats pels lisosomes i no puguin exercir els seus efectes. A partir d'aquestes deficiències dels liposomes tradicionals en el lliurament de fàrmacs genètics, les nanopartícules lipídiques (LNP) s'han desenvolupat i es converteixen en un mètode de lliurament important especialment adequat per lliurar àcids nucleics a cèl·lules i teixits objectiu.
Introducció al sistema portador LNP
Les nanopartícules lipídiques (LNP) són nanopartícules formades per substàncies semblants als lípids{0}} i un diàmetre generalment entre 10 i 200 nm. En comparació amb els liposomes tradicionals, són més petits i més fàcils de passar a través dels buits endotelials vasculars. A més, els LNP solen estar formats per lípids catiònics/ionitzables, fosfolípids auxiliars, lípids de polietilenglicol (PEG) i colesterol. Entre ells, els fosfolípids auxiliars i el colesterol poden augmentar l'estabilitat del LNP; Els lípids PEG ajuden a augmentar el temps de circulació de LNP in vivo i a reduir les reaccions immunitàries. Aquests components tenen funcions similars a les dels liposomes tradicionals. La diferència rau en els lípids catiònics/ionitzables, que també són la principal àrea de protecció de patents per a LNP.
Com s'ha esmentat anteriorment, els liposomes catiònics poden mantenir eficaçment la unió amb fàrmacs d'àcid nucleic i millorar l'eficiència de lliurament dels fàrmacs d'àcid nucleic. Tanmateix, els liposomes catiònics també són propensos a la unió no-específica amb proteïnes plasmàtiques carregades negativament, cèl·lules sanguínies, etc. a la circulació corporal, provocant l'agregació de liposomes i s'eliminen ràpidament del cos (la vida mitjana- dels liposomes catiònics in vivo és de només 15 minuts).
Per resoldre aquest problema, els investigadors han desenvolupat un nou tipus de material lipídic anomenat lípids ionitzables. Els lípids ionitzables són molt semblants als lípids catiònics en l'estructura. Prenent com a exemple el lípid catiònic comú DOTAP i el lípid ionitzable DODAP, la diferència és que DOTAP és una sal d'amoni quaternària amb càrrega positiva, mentre que DODAP és una estructura d'amina terciària. L'estructura de l'amina terciària pot mantenir el pKa del lípid entre 6-7. Quan el pH és inferior al pKa (en condicions àcides), els lípids ionitzables es carreguen positivament.
Quan el pH és proper al pKa (en condicions neutres), els lípids ionitzables són neutres. Aquest disseny pot resoldre intel·ligentment el problema que troben els liposomes catiònics: com que el pH de la circulació sanguínia és proper al neutre, els lípids ionitzables també són neutres i la unió inespecífica entre ells i les proteïnes plasmàtiques o les cèl·lules sanguínies es redueix significativament, allargant la vida mitjana-. A més, quan els LNP lípids ionitzables són absorbits per les cèl·lules i entren als lisosomes, els lípids s'ionitzen i es carreguen positivament a l'entorn lisosomal amb pH 5-6. Els lípids carregats positivament es fusionen fàcilment amb la membrana endosoma-lisosoma, permetent que els liposomes escapen al citoplasma, es dissociïn i alliberin àcids nucleics, exercint així els seus efectes. En resum, dissenyar un sistema portador de LNP implica optimitzar la composició de lípids, la mida de les partícules, la càrrega superficial i l'estabilitat per aconseguir un lliurament eficient de gens.
Estratègia de bioanàlisi LCMS per a fàrmacs genètics empaquetats-LNP
Els medicaments genètics envasats per LNP-consten principalment de la closca de LNP i el propi fàrmac genètic. La closca de LNP consta principalment de components lipídics (els lípids catiònics/ionitzables representen un 30-50%, els lípids PEG representen un 2%, el colesterol representen un 20-50%, els fosfolípids auxiliars representen un 10-20%), mentre que els fàrmacs gènics consisteixen principalment en seqüències gèniques i miRNA, fragments ASO, etc. D'acord amb les últimes regulacions de NMPA i FDA[14-15], per a l'aplicació IND de fàrmacs del sistema de lliurament de fàrmacs com el LNP, a més de realitzar estudis farmacològics i farmacocinètics sobre l'ingredient actiu (seqüència gènica), també es requereix una avaluació de seguretat i farmacèutica per a nous components lipídics que no s'han utilitzat en sistemes de lliurament de fàrmacs / medicaments ionitzables com ara lipids i EG. lípids amb modificacions especials en el LNP.
La bioanàlisi LCMS dels lípids LNP se centra en lípids catiònics/ionitzables i lípids PEG. A causa de les diferències estructurals entre ells, el pes molecular del lípid catiònic/ionitzable es troba generalment dins d'1 kDa, mentre que el pes molecular del lípid PEG pot arribar als 2 ~ 5 kDa després de portar grups de modificació, donant lloc a grans diferències en la retenció cromatogràfica i la resposta d'espectrometria de masses entre ells. Tenint en compte que el contingut de lípids catiònics/ionitzables en LNP és superior al del lípid PEG, la diferència de resposta condueix a la incapacitat d'unificar eficaçment els mètodes de pretractament (la selecció del dissolvent d'extracció, la determinació del factor de dilució) d'ambdós. A més, a causa de la presència de molts pics interferents al voltant de la posició màxima del lípid PEG, sovint es requereix un gradient de separació de fase líquida més llarg per a una separació efectiva, que no pot garantir una alta eficiència de l'anàlisi. Per tant, establim per separat el mètode de detecció de lípids PEG en bioanàlisi. Al mateix temps, el lípid catiònic/ionitzable i el lípid PEG també tenen dificultats comunes en el desenvolupament del mètode a causa dels seus components lipídics, com ara una mala solubilitat en aigua, inestabilitat a la matriu biològica, unió de proteïnes a la recuperació que supera el límit, alta interferència i residu de lípids PEG, canvi d'estabilitat del lípid en la matriu de mostra real i dificultat en la selecció d'estàndards interns.
